【儀表網 研發快訊】冷凍電子斷層成像(cryo-electron tomography,cryoET)技術、冷凍聚焦離子束(cryo-focused ion beam,cryoFIB)樣品減薄技術和子斷層平均技術(sub-tomogram averaging,STA)的進步推動了生物大分子在細胞中的原位結構測定，對于研究膜蛋白結構及其在細胞環境中的相互作用具有重要意義。斷層掃描圖像(tomogram)是三維圖像，但由于低信噪比和細胞內擁擠的環境，當前的觀察方法仍主要依賴查看tomogram中的二維截面。然而，細胞中的膜結構通常呈彎曲形態，這使得通過二維截面難以直接觀察膜表面蛋白的分布。同時，膜信號強烈的襯度也會干擾膜蛋白的識別，增加原位觀察和結構解析的難度。
近日，清華大學生命學院李雪明副教授課題組在《自然·通訊》(Nature Communications)在線發表題為“MPicker：冷凍電子斷層成像中膜蛋白的可視化與挑選”(MPicker:visualizing and picking membrane proteins for cryo-electron tomography)的研究論文。該論文報道了一種基于“膜展平”的方法，通過在“展平tomogram”中進行操作來降低膜蛋白可視化與挑選的難度(圖1)。該方法首先通過膜分割或者手動標注定位感興趣區域(一片膜)，然后在tomogram中對這片膜及其周圍的區域進行變形處理，最終把這個局部區域展平為一個包含平整膜結構的新tomogram，也就是展平tomogram。在這個新生成的展平tomogram中，原本彎曲的膜會變成一個平板，膜厚度與蛋白取向局部保持不變。展平tomogram中每一層二維截面都對應一個平行于膜的等距面，使得膜表面的蛋白信號可以輕易地以二維圖像的形式被展示。這起到了降維的效果，降低了膜蛋白分析的空間復雜性，改善了膜上和膜周圍蛋白質的可視化效果。
圖1.MPicker軟件流程圖
基于膜展平方法，研究團隊開發了名為MPicker的新軟件，該軟件能夠在多種細胞切片樣品的tomogram中清晰展示膜表面的蛋白分布(圖2)。在展平tomogram中，用戶可以更方便地識別并挑選顆粒。為了提高自動化程度，MPicker還整合了EPicker軟件(一款原本用于單顆粒圖像的自動顆粒挑選工具)，充分利用了展平tomogram二維化的優勢。除了在MPicker中進行操作，用戶也可以靈活地使用其他軟件在展平tomogram中進行顆粒挑選。
圖2.使用MPicker對類囊體膜進行展平
MPicker還可以提供每個顆粒的初始取向用于輔助膜蛋白STA的計算。除了常規的膜法向量，用戶還可以方便地通過MPicker在展平tomogram中標注蛋白在膜表面的面內取向，從而利用更強的角度約束來輔助STA的計算。為提高取向確定的自動化程度，研究團隊將膜蛋白沿膜法向量投影，并進行了改造的二維分類，從而更高效地獲得每個顆粒的精準取向信息。通過這一方法，團隊使用四套tomogram數據成功解析了衣藻PSII-LHCII超復合物的低分辨原位結構(圖3)，并將結果上傳至EMDB數據庫(EMD-61019)。
圖3.通過膜蛋白的法向量和面內角約束STA的計算
生命學院李雪明副教授為論文的通訊作者，生命學院2020級博士生顏嘯峰為論文的第一作者。電子系李樹東、黃煒琳，生命學院王皓博士(已畢業)，電子系趙天放、黃銘濤，冷凍電鏡平臺周昵昀博士，以及電子系沈淵教授為本研究作出了重要貢獻。研究得到國家自然科學基金委、生命科學聯合中心、北京生物結構前沿研究中心等的資金支持，并得到國家蛋白質科學研究(北京)設施清華基地的技術支持。
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