徠卡共聚焦課堂：光路篇

共聚焦顯微鏡是指一類可以記錄光學(xué)切片的特殊光學(xué)顯微鏡。

通過(guò)照亮和觀察單個(gè)衍射極限點(diǎn)，在激光共焦系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片。這需要兩個(gè)光束段焦點(diǎn)一致，因此是“共焦的”。與寬場(chǎng)成像不同，共聚焦圖像沒(méi)有散焦模糊情況。這本身就是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)闃悠飞顚拥膱D像顯示清晰，細(xì)節(jié)豐富。然而，最重要的優(yōu)勢(shì)是其具有微觀特征的三維可視化潛力。沿三維（z-stack）采集圖像序列后，由計(jì)算機(jī)重建和顯示三維物體。

一．共焦照明

通過(guò)將光源聚焦在小孔徑（針孔）上，然后聚焦到樣品中，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)光源照明。當(dāng)孔徑足夠小時(shí)，照明點(diǎn)僅受衍射限制，不受光源和孔徑幾何參數(shù)的限制。普通光源是大的面光源，是不可能將其聚焦到衍射極限的光點(diǎn)上。因此，盡管透過(guò)率非常低，這種聚焦照明光仍然是十分必要的（對(duì)于傳統(tǒng)源）。

圖1：用于共焦成像的照明。來(lái)自光源（Ls）的光聚焦于照明針孔（Pi），然后進(jìn)入樣品S。

激光作為光源具有非常高的準(zhǔn)直度（優(yōu)質(zhì)激光器提供的光“極度平行”）。因此，在不應(yīng)用針孔的情況下，激光可以通過(guò)單個(gè)透鏡聚焦到衍射極限的光點(diǎn)上。因此，大多數(shù)共聚焦顯微鏡沒(méi)有照明針孔。光點(diǎn)的質(zhì)量取決于激光的光束質(zhì)量。如果質(zhì)量不佳，也可以插入照明針孔。激光通常通過(guò)光纖耦合到共聚焦顯微鏡上。這些光纖本身也起針孔的作用。

激光的可聚焦性和高能量密度使其成為共聚焦顯微鏡的理想光源。激光的相干性不是共焦性能所需的特征。相反，這對(duì)光學(xué)設(shè)計(jì)師來(lái)說(shuō)是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樗鼤?huì)引起假的干擾圖案，因而需要謹(jǐn)慎的設(shè)計(jì)策略。

此外，傳統(tǒng)激光器僅發(fā)射單一顏色（激光-“譜線”），這一事實(shí)本身也有局限，在多熒光成像和測(cè)量時(shí)，就需要復(fù)雜的多激光排列。白激光很巧妙地解決了多色成像的問(wèn)題。

圖2：共焦（右側(cè)區(qū)域）和非共焦成像的比較。在Feulgen染色的小鼠滋養(yǎng)層中。非共焦圖像的很多信息并非來(lái)自焦平面。共焦光學(xué)消除了所有模糊的因素，使結(jié)構(gòu)變得清晰。

二．共聚焦檢測(cè)

大多數(shù)探測(cè)器具有相當(dāng)大的敏感區(qū)域（光電倍增管通常為幾平方厘米）。共焦光學(xué)器件需要點(diǎn)狀探測(cè)。因此，必須通過(guò)在光束中插入一個(gè)小孔徑（針孔）來(lái)執(zhí)行光點(diǎn)檢測(cè)。將樣品的光聚焦到該針孔上，收集并記錄透射光。

由于衍射模式取決于數(shù)值孔徑和波長(zhǎng)，所以必須進(jìn)行針孔檢測(cè)。因此當(dāng)這些參數(shù)改變時(shí)，必須調(diào)整針孔尺寸。

當(dāng)物鏡改變時(shí)（通常數(shù)值孔徑也會(huì)隨之改變），現(xiàn)代的共焦掃描顯微鏡會(huì)自動(dòng)適當(dāng)?shù)馗淖冡樋字睆健Ｒ虼耍樋淄ǔＴO(shè)計(jì)為雙層或多層光圈。

實(shí)際上，針孔的合適尺寸不僅取決于波長(zhǎng)和數(shù)值孔徑，還取決于顯微鏡中光學(xué)元件的內(nèi)部放大倍數(shù)。

因此，在設(shè)計(jì)不同的顯微鏡中直接比較針孔直徑不僅不可取，也是錯(cuò)誤的。如果針孔直徑未設(shè)置為值，系統(tǒng)將無(wú)法順利進(jìn)行光學(xué)切片（即傳輸散焦模糊），或者在沒(méi)有獲得進(jìn)一步的光學(xué)切片質(zhì)量的情況下不必要地阻斷信號(hào)（導(dǎo)致不必要的噪聲圖像）。

三．共焦掃描的光路

共焦掃描系統(tǒng)中的共聚焦光束路徑只是點(diǎn)光源照明和點(diǎn)探測(cè)的結(jié)合。這種組合可起到光學(xué)切片的效果。只有來(lái)自焦平面的光子才能傳遞到傳感器。而來(lái)自其他地方的所有光子都被濾除。通過(guò)“空間濾波器”的方式實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片。

由于在給定時(shí)間內(nèi)，只有一個(gè)光點(diǎn)出現(xiàn)“共聚焦”成像，因此需要一個(gè)掃描設(shè)備以柵格模式在物場(chǎng)上移動(dòng)該光點(diǎn)。通常情況下，光學(xué)鏡安裝在掃描電機(jī)上，用于執(zhí)行掃描程序。在掃描全幀（通常）1,024行所需的時(shí)間方面遇到了瓶頸。通過(guò)引入每秒掃描8,000或更多行的高速掃描儀（共振掃描儀），實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)。

只有在反射光顯微技術(shù)下才能實(shí)現(xiàn)良好的光學(xué)切片。這是近20年熒光顯微技術(shù)蓬勃發(fā)展的原因之一（其他原因還包括免疫染色、DNA-雜交、熒光生物傳感器、量子點(diǎn)和熒光蛋白的發(fā)明）。

圖4：從左至右：1. 照明錐不僅在焦平面內(nèi)激發(fā)熒光染料，在其上下都會(huì)激發(fā)。此處用綠色雙錐體表示。2. 發(fā)射針孔有效地截?cái)鄰慕蛊矫嫔戏桨l(fā)出的光。3. 此外，來(lái)自焦平面下方的光也不會(huì)通過(guò)針孔。4. 在共聚焦系統(tǒng)中，只有來(lái)自樣品焦平面的光才會(huì)到達(dá)檢測(cè)器。檢測(cè)針孔會(huì)有效拒絕來(lái)自其他區(qū)域的任何光。最終得到真正的光學(xué)切面。