新手小白Elisa實驗攻略

ELISA（酶聯免疫吸附試驗）是一種高靈敏度、特異性強的蛋白質定量檢測技術，廣泛用于科研和臨床檢測。其核心原理是利用抗原-抗體特異性結合，通過酶催化底物顯色來定量目標分子。常見的樣本類型包括血清、血漿、細胞培養上清、組織勻漿。

ELISA實驗基礎原理

ELISA（酶聯免疫吸附試驗）通過抗原抗體特異性結合，利用酶標記放大信號進行檢測。常見類型包括：

雙抗夾心法：適用于大分子抗原檢測

競爭法：適用于小分子或半抗原檢測

間接法：用于抗體檢測。

實驗準備

試劑和耗材檢查

1、確認試劑有效期：確保所有試劑如抗體、酶標二抗、底物溶液等均在有效期內。

2、試劑平衡：從冰箱取出的試劑需在室溫平衡20-30分鐘，避免溫度過高或過低影響反應效率。

3、標準品稀釋：嚴格按照說明書配制標準品梯度濃度，使用專用稀釋液，避免使用蒸餾水或生理鹽水替代。

4、樣本處理：血清/血漿樣本需規范收集，離心后取上清，避免溶血；細胞裂解液需確保裂解充分，離心去除雜質。

器材準備

酶標板檢查：確保酶標板無破損、漏液，使用前不可用手觸摸板孔底部。

加樣槍校準：校準移液器，確保準確加樣，槍頭需一次性使用，避免交叉污染。

操作步驟

夾心法ELISA示例

1.包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體，加入酶標板孔中，密封4℃過夜孵育。

2.洗板：棄去孔內液體，加滿洗滌緩沖液（PBST），靜置30秒后棄去，重復3次。

3.封閉：加入封閉緩沖液（含5% BSA或脫脂奶粉的PBST），密封37℃孵育1-2小時。

4.加樣：將稀釋好的標準品和待測樣品加入對應微孔，每孔100 μL，設置復孔和空白孔。

5.孵育：密封酶標板，37℃孵育1-2小時。

6.加檢測抗體：稀釋檢測抗體，加入每孔（空白孔除外），37℃孵育1小時。

7.洗板：同前，確保洗去未結合的成分。

8.底物反應：加入底物溶液，避光室溫孵育15-30分鐘。

9.終止反應：加入終止液，溶液顏色由藍色變為黃色。

10.檢測：用酶標儀在450 nm波長下測定各孔的吸光度（OD值）。

常見問題與原因分析

ELISA實驗成敗在于細節：

1、事前規劃：根據樣本量和頻率選擇合適規格試劑盒，避免浪費；

2、樣本質控：規范采集與保存，杜絕溶血、脂血、沉淀；

3、操作嚴謹：統一加樣、溫育、洗滌流程，減少人為誤差；

4、試劑保障：選用高特異性抗體與穩定試劑，關注有效期與儲存條件。

通過遵循上述攻略，可以提高ELISA實驗的成功率和數據的準確性。