制備型液相色譜的分離原理

制備型液相色譜（Preparative Liquid Chromatography, Prep-LC）是以獲取高純度、一定量目標化合物為核心目的的色譜技術，其分離原理與分析型液相色譜（Analytical LC）一致，均基于 “混合物中各組分與固定相、流動相之間作用力的差異”，實現組分在色譜柱內的遷移速度不同，最終達到分離效果。但制備型液相色譜在柱尺寸、樣品負載量、分離目的上與分析型有顯著區別（前者側重 “制備”，后者側重 “分析檢測”），其分離原理可從核心機制、關鍵作用力、分離過程三方面詳細解析。

一、核心分離機制：分配平衡與差速遷移

制備型液相色譜的本質是利用 “溶質（樣品組分）在固定相（色譜柱內填充物）和流動相（攜帶樣品的液體）之間的分配系數差異”，驅動各組分在色譜柱中以不同速度移動，從而實現分離。

分配平衡的定義

當樣品被流動相帶入色譜柱后，各組分將在固定相和流動相之間發生連續的溶解、吸附、解吸或離子交換等相互作用，并最終達到動態平衡。此時，組分在兩相間的濃度比稱為 “分配系數（K）”，公式為：

K = 組分在固定相中的濃度 / 組分在流動相中的濃度

差速遷移的結果

若某組分與固定相的作用力強（如吸附力、親和力高），則其分配系數 K大—— 該組分更傾向于 “停留在固定相上”，隨流動相向前遷移的速度慢。

若某組分與固定相的作用力弱（如吸附力、親和力低），則其分配系數 K小—— 該組分更傾向于 “溶解在流動相中”，隨流動相向前遷移的速度快。

最終，不同組分因遷移速度差異，在流經色譜柱后會先后從柱尾流出，通過檢測器（如紫外檢測器）識別后，收集目標組分的流出液，即可獲得高純度的制備樣品。

二、關鍵作用力：基于固定相類型的分離模式

制備型液相色譜的分離效果直接依賴于 “固定相的選擇”，不同固定相與組分的作用機制不同，形成了多種分離模式。其中，反相色譜（RP-HPLC）是制備型液相色譜中常用的模式，此外還有正相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜等，其核心作用力差異如下表所示：

1. 反相色譜

固定相特點：非極性（如 C18、C8 鍵合相）

流動相特點：極性（如水 - 甲醇、水 - 乙腈）

核心作用力：疏水作用（非極性組分與固定相間的疏水結合）

適用樣品類型：極性較弱的有機物（如藥物中間體、小分子化合物）

2. 正相色譜

固定相特點：極性（如硅膠、氨基鍵合相）

流動相特點：非極性（如正己烷 - 異丙醇）

核心作用力：極性作用（氫鍵、偶極 - 偶極作用）

適用樣品類型：極性較強的有機物（如糖類、有機酸）

3. 離子交換色譜

固定相特點：帶電荷基團（如磺酸基、季銨基）

流動相特點：緩沖液（如磷酸鹽緩沖液）

核心作用力：離子鍵作用（樣品離子與固定相電荷基團的靜電吸引）

適用樣品類型：離子型化合物（如氨基酸、蛋白質、核酸）

4. 凝膠滲透色譜

固定相特點：多孔凝膠（如聚苯乙烯凝膠）

流動相特點：與樣品互溶的溶劑（如四氫呋喃）

核心作用力：體積排阻作用（小分子進入凝膠孔，遷移慢；大分子被排斥，遷移快）

適用樣品類型：聚合物（如塑料、橡膠，用于分離不同分子量的聚合物）

三、完整分離過程（以反相制備型液相色譜為例）

制備型液相色譜的分離是一個 “樣品加載→柱內分離→組分流出→目標收集” 的連續過程，具體步驟如下：

1. 樣品預處理

制備前需對樣品進行純化（如過濾、萃取），去除雜質和不溶物，避免堵塞色譜柱；同時需將樣品溶解在與流動相初始比例一致的溶劑中，減少 “溶劑效應”（避免樣品與流動相極性差異過大導致的峰展寬）。

2. 樣品加載

通過進樣閥將大量樣品（通常為毫克至克級，遠高于分析型的微克級） 注入色譜柱頂端，樣品被流動相（初始極性較高，如 90% 水 + 10% 乙腈）攜帶，進入填充有 C18 固定相的色譜柱。

柱內梯度洗脫與分離

啟動梯度洗脫程序（逐漸提高流動相中有機相比例，如從 10% 乙腈升至 90% 乙腈）：

極性較強的雜質：與 C18 固定相疏水作用弱，分配系數 K 小，隨初始流動相快速遷移，先流出色譜柱。

目標組分：與 C18 固定相疏水作用中等，隨流動相極性降低（有機相比例升高），逐漸從固定相上解吸，以中等速度遷移。

極性較弱的雜質：與 C18 固定相疏水作用強，分配系數 K 大，需更高比例有機相才能解吸，最后流出色譜柱。

3. 組分檢測與收集

流出液經過檢測器（如紫外 - 可見檢測器，根據目標組分的最大吸收波長設定檢測波長，如 254nm），檢測器將組分濃度信號轉化為色譜峰（即 “制備色譜圖”）。當目標組分的色譜峰開始出現時，啟動收集裝置（如自動餾分收集器），收集整個目標峰的流出液；當目標峰結束后，停止收集，避免混入相鄰雜質峰。

后處理

收集到的目標組分溶液需通過旋轉蒸發、冷凍干燥等方式去除流動相，最終得到高純度（通常＞95%，甚至 99.9%）的固體或液體目標產物。