高效腸道屏障功能檢測方案：安捷倫Cytation＋艾瑋得器官芯片

腸道作為人體消化系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，其屏障功能宛如堅固防線，守護著機體健康，既阻止有害物質(zhì)入侵，又維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這在藥物研發(fā)、毒理學(xué)研究等諸多生物醫(yī)藥領(lǐng)域至關(guān)重要。但傳統(tǒng)檢測方法受技術(shù)瓶頸制約，在檢測效率及模擬真實生理環(huán)境方面表現(xiàn)欠佳，難以滿足科研快速推進的需求。

  澤匯生物引入的安捷倫 Cytation 與艾瑋得器官芯片強強聯(lián)合，將成像技術(shù)與類器官模型結(jié)合，整合成像分析技術(shù)與高度模擬人體生理微環(huán)境的優(yōu)勢，為腸道屏障功能檢測開辟出一條高效、的全新方案。

技術(shù)聯(lián)用的優(yōu)勢：

模擬生理環(huán)境：器官芯片可在芯片上構(gòu)建出包含腸道上皮細胞層、血管內(nèi)皮細胞層等類似體內(nèi)腸道組織的結(jié)構(gòu)，并通過微通道內(nèi)液體流動模擬腸道內(nèi)物質(zhì)運輸，而微孔板成像能對芯片內(nèi)細胞在這種模擬生理環(huán)境下的生長、形態(tài)變化及功能表達進行可視化監(jiān)測。

多維度數(shù)據(jù)獲取：微孔板成像技術(shù)中的熒光顯微鏡可觀察細胞熒光強度變化反映分子表達水平或代謝活性，共聚焦顯微鏡能實現(xiàn)細胞三維重建，結(jié)合器官芯片模擬的復(fù)雜微環(huán)境，可從細胞形態(tài)、分子表達、空間分布等多維度獲取細胞在 3D 培養(yǎng)條件下的數(shù)據(jù)

設(shè)備與方法

設(shè)備

Agilent細胞成像多功能微孔板檢測儀

l 顯微成像和微孔板檢測的整合可同時提供細胞表型數(shù)據(jù)和定量數(shù)據(jù)，提高實驗效率

l 集成化軟件簡單易用，分析模塊不設(shè)限

l 圖像采集、處理和數(shù)據(jù)分析輕松實現(xiàn)自動化流程

l 1.25 倍-100 倍物鏡，結(jié)合 7 種成像模式，為用戶提供更多選擇

l 超過 20 種熒光通道選擇，拼插式快捷更換，滿足現(xiàn)在和未來應(yīng)用

l 配置共聚焦成像和水鏡可清晰觀察3D細胞/類器官等較厚樣本

l 環(huán)境控制包括溫度和 CO₂/O₂ 控制與監(jiān)測，無需放置培養(yǎng)箱

l 支持與自動化設(shè)備對接，實現(xiàn)更高通量的檢測與成像分析

l 多種成像和檢測模式可進行數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，適用于任何檢測

艾瑋得高通量無膜屏障芯片

屏障芯片產(chǎn)品是一種創(chuàng)新性的可灌注 3D 培養(yǎng)芯片。它具備三通道獨立以及液體控制技術(shù)等特點，憑借這些特性，實驗人員能夠靈活安排細胞 / 組織的空間分布與共培養(yǎng)，實現(xiàn)物質(zhì)和信號的無障礙交互。在模型構(gòu)建方面，這款芯片優(yōu)勢明顯，可構(gòu)建多種管狀及復(fù)雜模型。并且，借助芯片自身的諸多優(yōu)勢，構(gòu)建出的模型能更接近人體實際情況。借助固體邊緣效應(yīng)構(gòu)建的無膜式屏障，該芯片不僅能對三通道中的細胞進行定位，還能更好地促進細胞間相互作用。此外，配合搖擺灌注儀使用時，該芯片還可達成連續(xù)動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)養(yǎng)分的充分交換，為細胞和組織的培養(yǎng)提供更適宜的環(huán)境，助力科研人員開展更深入的研究。

聯(lián)用方法

（二）芯片構(gòu)建與細胞接種

l 首先，在微流控芯片的細胞培養(yǎng)腔室中，利用微加工技術(shù)構(gòu)建細胞外基質(zhì)層。例如，將稀釋后的樣本細胞均勻地鋪展在腔室內(nèi)，使其形成類似于體內(nèi)細胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

l 將培養(yǎng)好的腸道上皮細胞以合適的密度接種到芯片的上皮細胞培養(yǎng)區(qū)域，同時可根據(jù)需要接種其他輔助細胞（如成纖維細胞等），構(gòu)建完整的腸道屏障模型。接種后，將芯片放置在培養(yǎng)箱中，讓細胞貼壁并開始生長。

l 在微孔板的孔中，接種與芯片上相同類型和狀態(tài)的細胞，作為對照或用于初步篩選實驗條件。

（三）成像與監(jiān)測

l 利用微孔板成像技術(shù)，在細胞接種后的不同時間點，對微孔板中的細胞進行成像。通過觀察細胞的形態(tài)、熒光標記物的表達等情況，初步評估細胞的生長狀態(tài)和功能變化。例如，使用熒光標記的緊密連接蛋白抗體，觀察細胞間緊密連接的形成情況，以評估腸道屏障的完整性。

l 由于芯片內(nèi)細胞的 3D 結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，成像時可采用共聚焦成像等技術(shù)（C10），獲取細胞在不同深度層面的信息，觀察細胞在模擬腸道微環(huán)境下的動態(tài)變化，如細胞的遷移、分化以及屏障功能的改變等。

應(yīng)用案例

01細胞培養(yǎng)：

使用人結(jié)腸腺癌細胞系 Caco-2 在器官芯片中制備腸道模型。器官芯片 的每個芯片由 9 個孔（3 x 3）組成，通過三個微流體通道（寬 400 µm，高 220 µm）連接。

圖 1. 在器官芯片中構(gòu)建 Caco-2 tubule 培養(yǎng)模型

02屏障完整性檢測：

在培養(yǎng)的第 6 天，向培養(yǎng)基通道 1 中加入含有熒光染料(FITC-Dextran 150 kDa，TRITC-Dextran 4.4 kDa)和凋亡誘導(dǎo)劑 Staurosporine(0 至 50 µM)的培養(yǎng)基，并立即使用 BioTek Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)對器官芯片進行成像。

Cytation 1 系統(tǒng)具有完善的環(huán)境控制，包括CO₂/O₂濃度控制和溫度控制，將系統(tǒng)溫度設(shè)置并維持在 37 ℃，在24小時內(nèi)每小時捕獲一次每個 OrganoPlate^® 芯片的熒光圖像。

圖 2. 使用安捷倫 BioTek Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)進行腸道屏障完整性測定

03結(jié)果與討論

Caco-2 細胞在器官芯片中培養(yǎng)，并用 Staurosporine(0 至 50 µM，24 小時)處理，然后使用 Cytation 1 評估其屏障完整性。

圖 3-4 數(shù)據(jù)觀察到：未加細胞和 0 µM Staurosporine 條件作為對照，顯示出預(yù)期的圖像和接近 1 和 0 的泄漏分數(shù)。

圖 3. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 FITC - 葡聚糖（150 kDa）的滲透性

圖 4. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 TRITC-dextran（4.4 kDa）的滲透性

圖 5 顯示在 Staurosporine 處理的細胞中，觀察到劑量和時間依賴性的屏障完整性喪失，表現(xiàn)為兩種熒光染料從培養(yǎng)基向凝膠通道的滲透。通過計算泄露分數(shù)和表觀滲透率（Papp），進一步量化了屏障功能的破壞程度。

圖 5. 屏障完整性數(shù)據(jù)分析和表觀滲透率

如果想要在器官芯片上進行更高分辨率的 3D 組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，推薦使用增加了轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)的 Cytation 高級型號：Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)。

圖 6. 器官芯片的 3D 渲染。使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦成像系統(tǒng)在 40 倍物鏡下獲取共聚焦熒光圖像。以 1 µm的步進在多個 z 高度采集 3 x 3 圖像拼接，跨越 150 微米的 Z 高度范圍。細胞核用 Hoechst 33342 標記，細胞膜用 GFP 標記。3D 渲染使用安捷倫 BioTek Gen5 軟件中的 3D 查看器工具生成。

引用文獻：

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