分子雜交探針種類及選擇

　探針的概念
　　放射性同位素、*或熒光染料進行標記的已知序列的核酸片段，即為探針（probe）。探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術，使雜交區帶顯現出來。

　　探針的種類極其選擇

　　基因探針根據標記物不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據探針的來源及核酸性質不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。

　　1、DNA探針
　　DNA探針是Z常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現已獲得DNA探針數量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。

　　DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術的發展和應用。以細菌為例，目前分子雜交技術用于細菌的分類和菌種鑒定比之G + C百分比值要準確的多，是細菌分類學的一個發展方向。加之分子雜交技術的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。

　　DNA探針（包括cDNA探針）的優點：
　　①這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。
　　②不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。
　　③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法等，能用于同位素和非同位素標記。

　　２、cDNA 探針
　　cDNA （complementary DNA）探針是指互補于mRNA的DNA分子，是由逆轉錄酶催化而產生的。該酶以RNA為模板，根據堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。 cDNA 探針是目前應用Z為廣泛的一種探針。

　　3、RNA探針：
　　RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率*。早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉錄或病毒復制過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。

　　克隆探針：
　　前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首*行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應用克隆。
克隆探針的優點：[1]特異性強，從統計學角度而言， 較長的序列復雜度高，隨機碰撞互補序列的機會較短序列少；[2]可獲得較強的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標記基團更多。

　　4、寡核酸探針：
　　根據已知的核酸序列，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。若不知核酸序列，可根據蛋白質的氨基酸順序推倒出核酸順序，但要考慮到密碼子的兼并性。多用于克隆篩選和點突變分析。

　　人工合成的寡核酸探針有下述優點：
　　①短的探針比長探針雜交速度快，特異性。
　　②可以在短時間內大量制備。
　　③在合成中進行標記制成探針。
　　④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復性，提高雜交效率。
　　⑤寡核苷酸探針可以檢測小DNA段，在嚴格的雜交條件下，可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。

　　篩選寡核苷酸針的原則 ：
　　①長18～50bp，較長探針雜交時間較長合成量低；較短探針特異性會差些。
　　②堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。
　　③探針分子內不應存在互補區，否則會出現抑制探針雜交的“發夾”狀結構。
　　④避免單一堿基的重復出現（不能多于4個），如-CCCCC-。
　　⑤一旦選定某一序更符合上述標準，將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區域的同源性不能超過70%或有連續8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

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